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HiPfu DNA聚合酶是从克隆有Pyrococcus furiosis DNA Polymerase基因的大肠杆菌中分离纯化的，经过基因工程改造后大大提高了活性、稳定性、延伸速度等指标。HiPfu DNA Polymerase具有5'→3' DNA聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，能纠正DNA扩增过程中产生的碱基错配。HiPfu DNA Polymerase是目前已发现的所有耐高温DNA Polymerase中出错率极低的。非常适合用于高保真PCR扩增。其PCR产物为平端，可直接用平端载体克隆。

用于DNA的高保真扩增，如基因表达克隆、基因定点突变、细胞内基因点突变分析（SNP）和平末端补平等。


1单位（U）HiPfu DNA Polymerase活力定义为在74℃、30分钟内，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板引物，将10nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。

组分	500U	3000U
HiPfu DNA Polymerase(5U/μL)	100μL	600μL
10×HiPfu Buffer	1mL	1mL×6
SuperPure dNTP mix(10mM Each)	200μL	1.2mL

保存：-20℃


50mM Tris-HCl(pH8.2)，0.1mM EDTA，1mM DTT，Stabilizers，50% glycerol。


10×HiPfu Buffer：
200mM Tris-HCl(pH8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2 SO4，20mM MgSO4，其他成分。


SDS-PAGE检测纯度大于99%，经检测无外源核酸酶活性；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；室温存放一周，无明显活性改变。

• HiPfu DNA聚合酶具有3'→5'的外切酶活性，所以HiPfu酶扩增时延伸速度比Taq酶低，应根据扩增产物的长度设置相应的延伸时间，建议HiPfu酶的延伸速度为每分钟1kb如扩增片段小于4kb；延伸速度为每分钟0.5kb如扩增片段大于4kb。同时HiPfu酶的3'→5'的外切酶活性可能降解引物，所以应先加dNTP后，再加HiPfu酶到反应体系中，并立即进行PCR反应。
  
• 用HiPfu DNA聚合酶扩增时，引物的纯度要求较高，引物长度大于18个碱基，Tm在55～80℃之间，引物浓度在0.1～0.5μM之间，比Taq酶略高。
  
• HiPfu DNA聚合酶的热稳定性比Taq酶好，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，对HiPfu酶的活性无影响。
  
• 高保真HiPfu酶对于dNTP纯度要求很高，因此建议用本酶配套的超纯dNTP mix。

• 按下表配制反应体系：
  

  成分	用量
  Template	<0.5μg
  Forward Primer(10μM)	1μL
  Reverse Primer(10μM)	1μL
  10×Buffer(With MgSO4)	5μL
  SuperPure dNTP mix(10mM Each)	1μL
  HiPfu DNA polymerase(5U/μL)	0.5μL
  ddH2O	至50μL

  • 模板参考用量(50μL体系)：质粒(0.1～10ng)，细菌基因组(10～100ng)，人类基因组(50～150ng)，cDNA(1～5μL)。
• PCR反应循环的设置：
  

  温度	时间	循环数
  94℃	2～5min	1
  94℃	30sec	30
  50～60℃	30sec
  72℃	0.5～1kb/min
  72℃	5～10min	1

  • 以质粒为模板扩增，一般1kb/min就足够了。

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